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  摘要

  1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,在聚酯合成领域有很好的应用前景,其生物生产方法已经引起了广泛的重视。在主要的1,3-PD生产菌之一--克雷伯肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)中,甘油通过两个酶转化成1,3-PD,分别是甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)。

  本实验克隆了 K pneumoniae中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dh“T,在大肠杆菌中进行了表达研究。采用胞内表达方式,1,3-丙二醇氧化还原酶以很好的可溶性蛋白存在,酶活达到96.8U/ml.

  经亲和层析纯化后,研究了重组1,3-丙二醇氧化还原酶的pH稳定性及温度稳定性,重组酶的最适pH为9.5,最适温度为30°C.

  克隆了 K pneumoniae中编码甘油脱水酵的dhaB基因,构建了三种不同的表达质粒,在大肠杆菌中进行了表达研究。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,直接表达整个阅读框架时,只有a亚基得到表达;串连表达时,在基因之间引入人为设计的RBS序列,能够有效的表达甘油脱水酶的三个亚基;融合表达则是去掉了 dhaBl及rf/uzB2的终止密码,在两两亚基之间各引入了 10个简单氨基酸残基。

  串连表达方式的酶活最高,经进分离纯化后酶活达90U/mg.克隆了甘油脱水酶再激活因子的基因并在大肠杆菌中实现了表达,作为甘油脱水酶的分子伴侣,再激活因子能够有效的激活失活的甘油脱水酶,使得甘油脱水酶在催化甘油转化为3-羟基丙醛时的活力大大提闻。

  利用含有不相容质粒的重组大肠杆菌系统,双质粒共同表达1,3-丙二醇代谢途径中的关键酶基因dhaB和dhaT,以及甘油脱水酶再激活因子基因WrAB,在有选择压力存在的条件下,重组菌可以保持较好的质粒稳定性,同时可以有效的表达目的蛋白。另外尝试了使用1,3-丙二醇氧化还原酶的同功酶一一醇氧化还原酶编码基因yqhD替代办flT,构建的两株重组菌的1,3-丙二醇产量分别达到8.6g/1 和 13.2g/l.

  为了提高K pneumoniae的生产强度及效率,本实验构建了表达质粒pKP-28a-flf/wBY,并在K体内进行表达,利用重组菌生产1,3-丙二醇,无论在厌氧还是微氧条件下,重组菌1,3-丙二醇代谢途径关键酶的酶活显着提高。

  对构建的重组克雷伯肺炎杆菌进行了微氧发酵,转化率比厌氧时稍微降低,但1,3-丙二醇浓度和生产强度有所提高。在微氧条件下以葡萄糖为辅助碳源进行发酵,初始添加8 g/1葡萄糖可以将生产强度提高30%以上;以甘油:葡萄糖=8: 1的比例补料可以将甘油转化率提高16%;发酵初始和补料均添加葡萄糖时,重组菌的1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度比野生克雷伯菌依次提高了19.2% > 8.3%和19.2%.釆用重组克雷伯肺炎杆菌结合微氧和加糖的补料批式发酵,1,3-丙二醇浓度(69.5 g/1)、甘油转化率(0.65mol/mol)和生产强度(2.32 g/lh)比最初的野生型厌氧发酵的1,3-丙二醇浓度(55.6 g/1)、甘油转化率(0.54 mol/mol)和生产强度(1.25g/lh)依次提高了 25%、20.4%和85.6%,而且发酵过程中乳酸含量极低。

  为了提高重组的产物耐受力从而提高产量,本研究使用紫外线一氯化锂复合诱变联合菌种驯化的方法,对构建的重组IC pneumoniae进行了诱变与筛选工作,获得了可耐受较高1,3-丙二醇浓度的优良突变菌株M-5.与诱变驯化前相比,1,3-丙二醇产量提高了 24%,乙酸产量也有相应的提高,而乙醇产量有所降低。

  与最初的野生克雷伯肺炎杆菌厌氧发酵相比,1,3-丙二醇产量提高了56.1%,生产强度提高了 131.5%.经过30L发酵罐放大,产量基本维持在87g/l.

  通过同源重组的手段敲除了 K pneumoniae的乙醛脱氢酶基因。

  摇瓶筛选得到了三株突变菌株,将乙醇产量最低的6号突变株应用于发酵中,发酵进行到12h?16h,菌体停止生长,代谢也基本停止,不再产生1,3-丙二醇,和亲株同期相比,生物量少了 3个OD,乙醇浓度减少了 37%,乙酸浓度比亲株同期增大了一倍,菌体生长受到明显影响。通过驯化提高菌体对乙酸的耐受力有望改变这种不利状况。

  摘要

  多元、泛在、网络化的信息感知是未来城市交通统一协作管理、科学可持续发展的重要基础,高效合理的感知系统能够为城市交通综合运营管理提供全方面的数据支持。建立完善的交通感知系统及其传感器网络可以有效的推动城市交通信息化、工业化融合,并加快交通运输业向便捷、安全、高效、经济的综合运输体系发展。因此对用于交通领域的感知系统及其传感器网络的实现技术研究、性能评估研究、状态优化研究等问题成为未来交通信息获取领域的重点和难点,对此类问题的研究具有重要的理论意义和现实指导作用。

  本文以城市交通组成元素的全息感知为研究背景,深入研究了获取交通信息的感知系统及其传感器网络,对交通智能感知的相关概念进行定义,提出感知系统的通用架构及性能评价方法,并通过研究不同层次的性能优化算法对感知系统效能进行优化,幵发交通感知传感器网络实现技术,通过实际应用验证了本文所述理论方法的有效性,形成城市交通感知系统应用技术体系。本文的主要研究成果体现为以下几个方面:

  (1)形成城市交通感知系统体系及其通用架构。

  本文定义了交通感知、交通智能感知、交通智能感知系统及用于交通感知的传感器网络相关概念,系统地分析了城市交通感知的对象、感知方式以及感知结果,形成完整的城市交通信息系统结构;分析了传感器网络的组成结构及功能技术特点,提出一种具有普适性、可裁剪、易重构的城市交通传感器网络架构;通过对传感器网络进行形式化建模,定量分析带宽、时延及丢包率等关键参数对感知系统的性能影响,为论文的进一步研究奠定理论基础。

  (2)以优化网络传输性能、提高系统效率为目标,提出城市交通感知传感器网络性能优化方法。

  基于建造费用、可靠性、实时性的多方博弈过程,提出有线传感器网络性能优化方法;将有线网络性能优化过程分为物理拓扑优化和逻辑拓扑优化两层,对传感器网络的设计问题进行建模,通过双层规划的思想,将有线传感器网络的可靠性、建造费用与通信效率纳入统一的决策过程,从而建立传感器网络最优性能模型;基于纳什协商博弈论建立无线传感器网络资源分配模型,通过寻找系统中各业务传输效用的非对称纳什议价解从而确定资源分配方案,提高系统资源利用率;通过在列车车载有线网络和车地传输网络中分别进行的验证表明,本文所提出的两种优化模型及其求解算法具有较好的适用性,保证了传感器网络在实际工程中应用时的经济性、高效性及可靠性。

  (3)建立城市交通感知网络典型应用技术框架。

  分别在城市道路交通领域及轨道交通领域建立投入工程应用的传感器网络系统,研究相关系统在实现过程中的应用技术;将智能感知系统应用于轨道交通领域,提出一种用于城轨列车在途安全监测的感知系统,该系统分为车载大容量传感器网络以及车地无线传输网络;通过对列车感知系统的对象进行详细分析,确定其主要功能,并阐述实现该功能的系统架构以及实现方法;最后给出一种列车通信网络实验平台的设计方案,该平台能够兼容目前主流的各种通信协议,并提供完整的系统功能模拟及故障注入功能,为评估城市交通感知系统及其传感器网络的性能、验证系统优化效果以及分析系统可用性提供实物依据;将智能感知系统应用于城市道路交通领域,建立车型识别传感器网络,研究用于该系统的多传感器信息交叉匹配技术,提出基于最大似然估计的信息相关性匹配模型,用于提取同一感知对象在大规模传感器网络中被多次捕获的特征;提出了多传感器匹配信息的融合技术,并将其用于道路车辆车型分类的识别过程;实例证明该方法能够为现有车型识别技术提供更加精确的输入参数,有效提高车型识别准确率。

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