传统与改良影印培养法在生物实验中的应用综述

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  自1992年发明以来,作为一种重要的筛选方法被用在微生物及遗传学中的各个领域,这种筛选方法对微生物突变菌株,基因突变体等的筛选起到了很重要的作用,然而传统影印培养法在使用过程中表现出使用的丝绒材料价格较贵、需反复灭菌和使用不便等缺点,为了使该方法操作简便快捷可靠,不断的出现改良的影印培养法。本文从传统影印培养法到改良影印培养法在生物实验中的应用予以综述。

  1 传统影印培养法

  1952年Lederberg发明了影印培养法,该方法是将原始菌落影印在一系列选择性平板的相同位置上,用这种方法能够筛选得到相同遗传型的菌落,其过程是:把长有菌落的原始培养皿倒置于包有绒布(已灭菌)的木质圆柱(直径略小于培养皿直径)上,使平板上的菌落影印在绒布上,然后把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上,待这些平板培养后,对各平板相同位置上的菌落作对比,就可筛选出所需的突变型菌株。图1就是利用影印培养法证明E.coliK12自发地产生抗链霉素突变株的实验示意图。其方法是:首先把大量对链霉素敏感的E.

  coliK12细胞涂布在不含链霉素的平板上,待其长出许多小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基平板上,然后再影印到含有链霉素的选择性培养基平板上。影印的作用主要是保证三个平板上培养的菌落具有亲缘性和菌落在平板上生长的位置保持严格的对应性。经培养后,在平板上有个别抗链霉素的菌落生长,对培养皿和进行比较,就能在平板的相应位置找出平板上生长的那几个抗性菌落的“孪生兄弟”。然后把平板中对应位置上的菌落挑至不含链霉素的培养液中培养,然后再涂布在平板上,然后重复上述步骤。反复重复上述同一过程后,就只要在培养皿和中涂上越来越少的原菌液后,便可在平板上长出越来越多的抗性菌落,这样便可得到完全纯的抗性菌株群体。由此可知,在这个过程中,原始的链霉素敏感菌株只通过移种和选择序列,也就是说在根本未接触过任何一点链霉素的情况下,便可以筛选到抗链霉素的突变株。影印培养法实验最初的设计是为证明微生物的抗药性突变是自发的,与相应的环境因素无关,目前已被广泛的应用在营养缺陷型的筛选及抗药性菌株的筛选等研究工作中。

  但是传统影印培养法在实验过程中有一定的缺陷,主要表现在以下四个方面:①不适合菌落密度大的平板。在影印过程中,原始菌落转移至丝绒上时需要摁压,菌落被压平,菌落面积扩大,从而在子板上形成接近扁平样的菌落。细菌密度高或者分布不均匀,就会造成菌落间的污染;②生长节奏不同,体积大小不同的菌落,影印效果不同。会出现污染或者筛选不到所需要的菌落等缺点;③平板上的边缘和中央影印效果不同。边缘部分比中央部分容易受力,所以边缘部分比中央部分易于影印,因此为了照顾平板中央菌落的影印效果,容易造成边缘菌落受压过大,菌落变形的情况,尤其在第二次影印时表现明显;④影印要求高质量的丝绒。价格比较昂贵,其次每次需要将绒布固定于圆柱面上,所以操作步骤复杂也增加了污染的可能性。

  2 改良的平板影印工具

  徐民俊等在对生产用酿酒酵母进行遗传改良的实验中,对传统影印平板工具进行了改良,改良后的影印平板工具是将长度一样的大量竹签捆扎成与平皿内盖直径相近的捆,整平接触菌落的面,然后将背面用胶粘于平皿内盖,60℃烘干,灭菌待用(图2)。影印时将该工具与细菌接触的面朝上平放在超净台上,打开上盖即可,如果需要反复使用该工具,可在第一次影印后,将影印的一面在75%乙醇中浸泡2min,轻轻甩去过多的无水乙醇,在超净台上吹干5min即可重复使用。也可以制备多套,统一灭菌。徐民俊等使用改良的影印平板工具进行3轮影印传代后,顺利地筛选出大规模的转化子。该改良的平板影印工具与传统平板影印方法有很大的区别,使影印操作更为简便,减少了污染的可能性,并且影印效果清晰,可以达到与母板相同的生长状况。

  改良的影印平板工具具有三方面的优点:①材料经济,工艺简单,操作简便,无需其他介质,降低了污染;②边缘菌落和中央菌落影印效果几乎相同,大菌落和小菌落影印效果也相同;③影印效果良好。影印时不会将菌落压平,无论影印几版,皆不会使菌落扩散,因此避免了菌落间的交叉污染。该工具也存在两方面的缺点:①直径大于2mm的菌落,将会导致一个母板菌落形成2个子板菌落。②由于材料是用竹签制作的,灭菌多次之后竹签会变的脆弱,所以使用时间不长,如果要批量生产,材料换成钢铁类则可长期使用。

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  3 低熔点琼脂糖影印培养法

  ShobhanaNatarajan等将传统的影印培养法进行改良,用改良的低熔点琼脂糖影印培养法简单快速的转移了哺乳动物细胞,然后用接种环挑取阳性克隆,筛选得到需要表型的细胞,这种转移速度较快,大大地减少了培养和分离稀有表型所花费的时间。具体过程如图3所示,细胞培养在直径为10cm的培养皿中,长到肉眼可见≥1000个细胞时影印,每个平板的培养基是20ml3%的低熔点琼脂糖冷却到37℃后,和2.5ml10×浓缩生长培养基以及2.5ml的血清混合(终浓度为1×培养基和10%血清),培养后用PBS洗掉平板中的血清,并在室温下向每个平板的细胞中添加1mL的Trypsin-EDTA,在显微镜下观察平板,待每个克隆中均有一些细胞变圆时弃去胰蛋白酶,并用含有琼脂糖的新鲜培养基(包含添加血清的生长培养基)培养10~15分钟,使其在平板中继续生长。一个无菌的V型小竹板插在琼脂糖中作为参考标记,这个参考标记插入的位置在原始平板的底部,然后将这个平板反向影印在直径为15cm的培养皿中,同时在第一个平板中加入生长培养基让每个克隆(包含大多数的细胞)剩余的细胞继续生长,接着将第二个直径为10cm的平板中的琼脂糖倒入10cm的培养皿中,克隆也随着转移,插入的参考标记随后放在第二个平板中,用巴斯德吸管在琼脂糖上戳眼来赶走培养基中的气泡,为了使转移的细胞粘附在培养皿中,将培养皿在37℃下孵育16~24小时。

  此种改良方法应用在细胞转移实验中,比较新颖,在这种方法中用低熔点琼脂糖来作为影印工具,这种工具可以随培养基一起配置,减少了外面介质,因此减少了污染的可能性。其次,在此方法中可以利用琼脂糖的低熔点性来控制影印,在温度高的时候琼脂糖溶解在培养基中,起到培养细胞的作用,温度低时琼脂糖凝固,作为固体介质进行影印。再次细胞培养时细胞都贴壁,用胰蛋白酶消化可以使细胞脱落,消化的程度可以控制脱落的浓度,到适合浓度时进行影印,最适合的细胞浓度为每个培养皿20~50个克隆时,可以减少克隆之间的交叉感染。

  4 结语

  自从1952年Lederberg发明了影印培养法以来,已经被广泛的用在细菌和酵母遗传学来筛选需要的表型,在细胞转移和筛选方面用的较少,也能够用抗体染色的方法来鉴定目的基因不同表达程度的克隆,筛选抗菌素,筛选抗菌活性强的肽,从环境中分离有益的微生物,在限制性温度下来鉴定易感的克隆,或者根据应用和特殊表型的需要进行其它筛选,因此在生物实验中具有重要的指导意义。本文从传统的影印培养法技术到改良的影印培养技术,从应用此技术来筛选突变菌株到筛选需要表型的细胞进行探讨,传统影印培养技术的影印工具是绒布,徐民俊等改良的影印工具是扎成捆的牙签,ShobhanaNatarajan等改良的影印工具是低熔点的琼脂糖,并用灭菌的小竹板插入培养基中做标记,这几种技术各有利弊,具体可以根据实验需要来选用,也可以根据实验自行进行改良。根据前面所述,发现在影印培养技术中克隆之间的污染是一个很重要的问题,解决此问题,实验操作中注意事项是一方面,主要的方面还有克隆密度的大小,如果克隆密度太大,可能不适合用这种技术来筛选,因为影印之后克隆之间不能很好地分开,达不到筛选的作用,也可能会造成污染。影印培养中的参考标记的确定也很重要,如果标记不准确则会被误选。原始平板和影印平板的直径大小有一定的要求,要事先设计好,原始平板的直径要比影印平板的直径小,如果原始平板的直径大于等于影印平板的直径则不能进行影印。

  参考文献
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