RT-PCR技术克隆鸡NALP3基因的部分序列及其表达特征

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论文摘要

  1989 年,美国免疫学家 Janeway 在冷泉港会议上提出模式识别理论,认为某些病原体或其产物共有在进化上高度保守的特定分子结构,这种高度保守的分子结构称为病原相关分子模式( Pathogen-as-sociated molecular pattern,PAMP).PAMP 能被固有免疫细胞表面的相应受体,即模式识别受体( Pat-tern recognition receptor,PRR) 所识别,并相互作用激活免疫功能。

  在高等动物中迄今已经发现了三大家族的模式识别受体( PRR) ,分别是 Toll 样受体( TLR) 、视黄酸诱导基因样受体( RLR) 和 Nod 样受体( NLR) .

  目前研究最多的 PRRs 是 Toll 样受体( TLRs) ,他们位于细胞表面或内涵体中.NOD 样受体( NOD-like receptors,NLRs) 是近年来发现的胞质型模式识别受体( PRRs),通过识别病原相关分子模式( PAMPs) 迅速启动先天性免疫,并能通过信号传导启动适应性免疫,在机体的免疫防御中发挥重要作用.已知 NLRs 由 NOD 亚家族、NALP 亚家族和IPAF 亚家族等成员组成。NALP3 作为 NALP 亚家族成员,有研究结果表明其能识别多种微生物,并且与 TLR 受体有协同作用,在机体先天性免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用.

  本试验采用RT-PCR 技术克隆鸡NALP3 基因的部分序列,并检测鸡 NALP3 基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、小肠、输卵管、卵巢、睾丸和脑12 种组织中的表达情况,为进一步深入研究鸡 NALP3基因在禽类先天性免疫中的作用奠定基础。

  1 材料与方法
  
  1. 1 试验材料
  试验选择 12 周龄的公、母清远麻鸡各 3 只,解剖后分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、小肠、输卵管、卵巢、睾丸和脑 12 种组织,立即投入液氮中保存备用。试验用清远麻鸡来源于国家级地方鸡种基因库( 江苏) .

  1. 2 主要试剂和仪器
  TRNzol-A+ 总 RNA 提取试剂 ( DP421 ) 、Super-RealPreMix( SYBR Green,FP204-01 ) 、Quant cDNA第一链合成试剂盒 ( QuantScript RT Kit,KR103-04) 、pGM-T 克隆试剂盒( VT302-02) 、质粒小提试剂盒( TIAN prep Mini Plasmid Kit,DP103-02) 、DNA 产物纯化回收试剂盒 ( TIAN quick Midi PurificationKit,DP204-02 ) 购自 TIANGEN 公司; DNA markerDL2000 为 TaKaRa 公司产品; 琼脂糖和 DEPC 为Promega 公司产品。

  荧光定量分析采用 Stratagene 公司的 Mx3000P型 PCR 仪,PCR 仪( Eppendorfmastercycler) ; 凝胶成像系统( Tanon 3500R) ; 紫外分光光度计( GeneQuantII,Pharmacia Biotech) ; 高速冷冻离心机 ( Eppendorfcentrifuge 5417R) .

  1. 3 试验方法
  1. 3. 1 鸡 NALP3 基因部分 cDNA 片段的获得 采用TRNzol 法提取 12 种组织的总 RNA; 组织总 RNA 提取按照 TRNzol-A+总 RNA 提取试剂的说明书进行,提取的 RNA 沉淀用适量的 DEPC 溶解后,进行琼脂糖电泳检测,分光光度计检测 RNA 纯度和含量。经检测合格并定量的总 RNA 参照 cDNA 第一链合成试剂盒说明书逆转录成 cDNA.首先根据 GenBank 中已经公布的原鸡 NALP3 基因核苷酸预测序列( 登录号: XM_001233261. 2) ,采用 Primer Premier 5. 0 软件设计引物: 上游引物序列 5'-ACCGCTACACCAACCT-GAC-3'; 下游引物序列 5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3',目的序列片段长度为 210 bp.PCR 反应体系总体积20 μl,退火温度 60 ℃,72 ℃延伸 10 min,35 个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化后与 pGM-T 载体连接构建重组质粒,转化感受态大肠杆菌( E. coli) TOP10,挑取转化子于含氨苄抗性的LB 液体培养基中,37 ℃ 200 r / min 振摇培养过夜,用PCR 鉴定。鉴定正确的质粒的序列测定及引物序列合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

  1. 3. 2 鸡 NALP3 基因的组织表达差异分析 采用Real time-PCR 法检测鸡 NALP3 mRNA 在各组织中的表达情况。NALP3 荧光定量 PCR 引物为: 上游引物 5'-ACCGCTACACCAACCTGAC-3'; 下游引物 5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3',片段长度为 210 bp.内参 β-actin 引物为: 上游引物 5'-TGCTGTGTTC-CCATCTATCG-3'; 上游引物 5'-TTGGTGACAATAC-CGTGTTCA-3',片段长度为 150 bp.荧光定量 PCR反应体系( 20. 0 μl) 如下: cDNA 2. 0 μl,2×SYBR re-al-time PCR premix 10. 0 μl,50 × ROX reference dye0. 4 μl,上、下游引物各 0. 8 μl,ddH2O 6. 8 μl.40个循环 ( 95 ℃,20 s; 60 ℃,15 s; 72 ℃,15 s) ,将 cD-NA 样品进行 2 倍梯度稀释制作标准曲线,扩增后进行熔解曲线分析。

  用 Mx3000P 型 PCR 仪分析鸡 NALP3 基因在不同组织中的表达情况。Real-time PCR 反应为: ( 1)95 ℃ 15 min; ( 2) 95 ℃ 20 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,40 个循环; ( 3) 95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s.每一个循环结束后实时测定荧光值,全部循环结束后测量熔解曲线。按照参考文献[10]中 2-△△Ct方法分析 NALP3 基因的相对表达水平。

  2 结 果
  
  2. 1 NALP3 基因的中间段 cDNA 序列的克隆
  采用 RT-PCR 的方法获得条带单一、明亮的目的片段,经测序为 210 bp( 图 1) ,阴性对照管不加cDNA 模板,未见目的片段。【图1】
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  2. 2 Real-time PCR 标准曲线、扩增曲线和熔解曲线
  将 cDNA 样品进行 2 倍梯度稀释后,将 2 种标准品在同一试验中运行,进行 NALP3 和 β-actin 基因的定量 PCR 反应,得到标准曲线方程分别为: Y= -3. 425 lgx+33. 34 和 Y = -3. 486 lgx+23. 95.曲线拟合度( R2) 分别达到了 0. 998 和 1. 000,说明具有非常好的线性关系,扩增效率分别为 104. 6% 和102. 8% ,扩增效率相对偏差小于 5. 0% ,可以进行准确的定量。熔解曲线峰形单一,说明反应特异性好,符合 SYBR Green 染料的检出要求。2 个基因的特异性扩增产物均具有相同的峰值,重复性好,且无引物二聚体和非特异性峰的存在,说明产物的特异性较好,达到了荧光定量的要求( 图 2) .
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  2. 3 鸡 NALP3 基因在鸡不同组织中的表达
  以 β-actin 为内参照基因,采用相对定量的方法对鸡 NALP3 基因在鸡体内各组织中的表达水平进行检测,结果( 图3) 显示,鸡 NALP3 基因在所检测的 12种组织中均有表达,以小肠作为对照,表达量定为 1,其他各组织中的表达量分别为: 心脏 13. 30、胸腺11. 82、法氏囊 7. 13、脑 2. 25、睾丸 8. 26、肝脏 1. 16、脾脏2. 08、卵巢 2. 22、肾脏 3. 26、输卵管 3. 27 和肺脏5. 06,在心脏中的表达量最高,小肠中的表达量最低。【图3】
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  3 讨 论
  
  NALP3 是 NLR 受体家族的重要成员,具有重要生理意义,一旦突变会引起人类很多疾病,如寒冷诱导的自发性炎症综合征.有关 NALP3 基因已有较多研究,取得了很多研究进展,但主要集中于人和小鼠,尚未见在禽类中的研究报道。

  不同细胞、不同组织在生命活动中起到不同的作用,对某一基因在细胞水平或组织水平的表达分布特征以及在整个生命周期中表达时序性特征的研究,能够为基因的功能分析提供参考。目前已知NALP3 主要表达于巨噬细胞和外周血白细胞,但在组织中的分布情况尚不清楚,因此本文采用反转录 PCR 技术克隆鸡 NALP3 基因的部分 cDNA 片段,并采用荧光定量 PCR 技术检测鸡 12 种组织中NALP3 基因的相对表达水平,从转录水平研究NALP3 基因的组织分布情况。

  曾有研究检测了人的血液、骨髓、脉管、心脏、脑、淋巴结、胰腺、胎盘、脾脏、胸腺和气管等 11 种组织中 NALP3 基因表达情况,结果表明,在骨髓和胸腺中高表达,在血液、脑、胰腺中表达量相对较低,在其他几种组织中没有检测到 NALP3 表达.本试验采用荧光定量 PCR 方法,检测鸡 NALP3 mRNA在鸡体内各组织中的表达水平,结果表明,NALP3基因在 12 种组织中均有表达,但表达水平存在差异,在所检测的 3 个免疫器官中,胸腺和法氏囊表达量很高,但脾脏中表达量较低,说明 NALP3 中枢免疫器官中可能发挥更重要作用。在具有性别特征的器官中,睾丸中表达量很高,而输卵管和卵巢中表达量较低,提示 NALP3 基因的表达可能与性别有关。

  另外,在所检测的 12 种组织中,NALP3 在心脏中表达量最高,小肠中表达量最低。我们的结果与在人中的研究结果有部分一致( 胸腺中高表达,脑中低表达) ,但我们检测到 NALP3 在鸡心脏中高表达,而在人心脏中却未被检测到,结果不一致,这可能与组织的来源和年龄等有关,提示 NALP3 的表达可能有时间和物种差异,这种差异还需做进一步验证。

  总之,NALP3 基因在鸡体各组织中广泛表达,表明鸡 NALP3 基因可能在鸡体内发挥重要的作用。

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