研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响

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论文摘要

  前言
  
  叶酸(folate)是在绿叶蔬菜、谷物和动物肝脏中发现的一种 B 族维生素,主要参与 DNA 合成和甲基化过程,对胎儿的生长发育至关重要。近年研究发现, 母体低叶酸水平可能会增高胎儿宫内发育迟缓(Intrauterine Growth Retardation, IUGR)的发生率,但其分子机制尚不清楚;以往动物模型的研究提示叶酸缺乏会引起胎鼠重量下降,但也没有对其进一步的机制探讨。

  目前认为,IUGR 的病因是多种因素作用的结果, 其病因学包括环境因素和遗传因素。现今很多研究证实胰岛素生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、瘦素(leptin)、葡萄糖转运蛋白(Glut)及凝血因子Ⅳ等与胎儿 IUGR 密切相关.胰岛素或IGF 分泌和功能的异常,是目前研究的热点.IGF 是生长发育所必需的、起重要作用的生长调节因子, 是胎儿出生前和出生后生长的主要刺激物,与婴儿出生体重密切相关.IGF 系统包括胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰岛素生长因子Ⅱ(IGF–Ⅱ)、胰岛素生长因子受体Ⅰ(IGF-ⅠR)、胰岛素生长因子受体Ⅱ(IGF–ⅡR)、胰岛素生长因子结合蛋白 1(IGFBP-1)和胰岛素生长因子结合蛋白 3(IGFBP-3)等,IGF-Ⅰ、IGF–Ⅱ结构类似于胰岛素,是重要的促分裂素,影响细胞生长和代谢,并通过自分泌、旁分泌和内分泌方式影响细胞增殖和分化,调节机体的生长发育.近期有研究表明,叶酸缺乏会导致孕鼠血清和孕18 天胎鼠颅骨中 IGF-1 蛋白含量降低;韩国 Kim HW 的一项研究也表明雄鼠叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑中 IGFⅡ的表达量下降,这说明叶酸缺乏可能会影响 IGF 系统相关基因的表达水平。

  本实验通过建立叶酸缺乏孕鼠模型,研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响,并在叶酸主要存储器官肝脏组织中测定了 IGF 系统相关基因表达水平,进而对叶酸缺乏致胚胎异常发育的机制进行了初步的探讨。

  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  C57BL/6J 清洁级雌性成年小鼠 12 只购自中国医科院实验动物中心,饲料配方中的氨基酸、维生素等购自美国 Sigma公司。实时荧光定量 PCR 仪(7500 fast) 为 ABI 公司产品;Nan-odrop 1000 分光光度计为 Thermo Scientific 公司产品;引物自上海生物工程技术有限公司合成;荧光染料 SYBR Green I 购自康为世纪公司;RNA 提取试剂盒购自美国 QIAGEN 公司;RNA 反转录试剂盒购自美国 Invitrogen 公司。

  1.2 方法
  1.2.1 动物模型的制备 健康清洁级未经产的成年 C57BL/6J 雌鼠 12 只,12 周龄,体重 19.1-21.2 g.按体重排序,随机分为正常对照组(Control)和叶酸缺乏组(FD)两组,每组 6 只。对照组小鼠喂养饲料以 AIN-93G 标准饲料配方为基础,其中氨基酸、矿物质和维生素混合物按 Bills N.D.等人建立的氨基酸限定配方进行调整;叶酸缺乏组小鼠喂养饲料是在对照组基础上剔除掉叶酸,具体成分详见表 1.两组小鼠皆自由进水和饮食,所有雌鼠先饲养于普通塑料笼具内单笼喂养,4 周后与正常成年C57BL/6J 雄鼠 1:1 合笼交配。每日下午 17:00 合笼,次日清晨检查阴栓,阴道口有乳白色或黄色凝固物者为见栓,记为 E0.5d,后转入普通饲养笼中,继续喂饲各自饲料直至取材。本研究使用的动物由实验动物使用与管理委员会审查许可(编号:IL-AS-PL-2012-001)。【表1】
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  1.2.2 实验记录及取材 每周用电子天平称量雌鼠体重,准确至小数点后一位数。取材时间为孕 13.5 天(13.5 dpc)当天的 8:00~10:00,记录孕鼠每窝总胎数、活胎数、吸收胎数和死胎数;测量记录胎盘重量、胎鼠重量、胎鼠体长。计算并统计胎鼠 IU-GR 比率,以正常对照组胎鼠平均出生体重减去该组标准差的2 倍为基准,胎鼠重量小于或等于此标准者评定为 IUGR.取13.5 dpc 胎鼠肝脏组织,每一窝胎鼠的组织放入同一个冻存管中,液氮速冻,-80℃冰箱保存。

  1.2.3 实时荧光定量 PCR 称取 13.5 dpc 小鼠胚胎肝脏组织 20mg,每组各 6 个标本,采用离心柱法提取总 RNA,Nanodrop1000 分光光度计测总 RNA 浓度。采用 Real-time PCR 法检测肝脏组织中 IGFⅠ、IGFⅠR、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、IGFBP-1 和 IGF-BP-3 mRNA 的水平,引物序列见表 2.Real-time PCR 反应体系20 μL,扩增反应条件为:50 ℃ 20 s、95 ℃ 10 min 后,以 95 ℃15 s、60 ℃ 1 min 循环 40 次,每份样本做三个重复孔。采用与内参基因 Gapdh 比较的△△CT 法计算 IGF mRNA 的相对表达量。【表2】
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  1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0 软件,数据以± SEM 表示,组间计量资料的比较采用独立样本 t 检验,吸收胎与死胎的比率、IUGR 发生率的比较采用 X2检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

  2 结果
  
  2.1 两组雌鼠体重的变化
  随机分组的两组雌鼠的初始体重没有统计学差异(P>0.05),在分别饲以相应饲料后,与正常对照组相比,叶酸缺乏组雌鼠合笼前四周体重每日的增长量降低,差异有统计学意义(P<0.05);而孕后至取材时的雌鼠体重每日的增长量两组间没有差别(P>0.05)(表 3)。【表3】
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  2.2 两组孕鼠吸收胎和死胎发生率的比较
  在 13.5 dpc 取材时叶酸缺乏组的胎鼠总数为 51 只,其中吸收胎 14 例;正常对照组的胎鼠总数为 54 只,其中吸收胎 3例,死胎 3 例;与对照组相比,叶酸缺乏组吸收胎和死胎率升高1.47 倍,X2检验结果显示,两组差异具有统计学意义(P<0.05) (表 4)。【表4】

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  2.3 胚胎发育评价及 IUGR 发生率的比较
  两组孕鼠(每组 6 只)解剖结果发现,叶酸缺乏组有 37 例活胎,正常对照组有 48 例活胎,为两组间胎鼠的形态对比图,可见叶酸缺乏组胎鼠体型偏小。与对照组相比,叶酸缺乏组平均胎鼠重量显着降低,是正常对照组胎鼠重量的 74.06 %,差异具有显着性(P<0.01)。计算统计两组间胚胎 IUGR 的发生率,分析发现叶酸缺乏组显着高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。胎盘重量和胎鼠顶臀长分析结果显示叶酸缺乏组略低于正常组,但没有统计学差异(P>0.05)(表 5)。【表5】
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  2.4 胎鼠肝脏 IGF 系统基因相对表达量变化
  胎鼠肝脏标本中 IGF 系统 mRNA 的相对表达水平分析结果显示,叶酸缺乏组 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR mRNA 水平均低于正常对照组,分别降低 58.45 %和 32.64 %,且两组间差异有统计学意义(P<0.05);相反,IGFⅠ、IGFⅠR、IGFBP-1 和 IGFBP-3 的mRNA 相对表达水平,两组间没有统计学差异(P>0.05)。

  3 讨论
  
  3.1 叶酸缺乏与胚胎发育叶酸作为一种水溶性维生素,参与 DNA 的合成与甲基化,对细胞的生长至关重要,近年来很多文献报道发现叶酸和胎儿发育关系密切。Sram RJ和 Relton CL 等人发现在早期妊娠的孕妇和新生儿中,有吸烟习惯的孕妇叶酸水平降低,且新生儿体重普遍偏低,两者高度相关。巴基斯坦的 Lindblad B发现IUGR 组母血和脐血中叶酸的水平是正常对照组的一半;澳大利亚的 Furness D 学者发现妊娠 18-20 周、发生 IUGR 的孕妇中,红细胞叶酸水平低于对照组,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)高于对照组,并且在淋巴细胞可见 DNA 损伤的标志 - 微核和核质桥现象增多,这表明在妊娠中期母体的低叶酸和高Hcy 水平与 IUGR 相关。印度的 Gadhok AK通过采集妊娠晚期 150 名 IUGR 和 30 名正常孕妇的血样,比较 Hcy、叶酸和VB12 的水平,发现 IUGR 组孕妇血清 Hcy 的浓度高于对照组,而叶酸和 VB12 的浓度低于对照组。国内的蔡卫华分别研究了不同孕期的 IUGR 孕妇,发现 IUGR 组各孕期红细胞叶酸水平均低于对照组,且新生儿体重与母血红细胞叶酸水平密切相关。综上所述,妊娠早期、中期、晚期孕妇自身的低叶酸水平都会导致新生儿 IUGR 的发生率上升。

  叶酸缺乏动物研究结果也发现,低叶酸饮食母鼠的怀孕率降低,孕鼠的孕期体重增加减少,孕鼠宫内活胎数减少,吸收胎、死胎比率增加,胎鼠重量下降,而大部分活胎的大体形态学都显示正常.Xiao S 等建立的叶酸缺乏模型是在饲料中添加 0.033 mg/kg、0.066 mg/kg、0.132 mg/kg 等不同含量的叶酸,并且加入 1 %的琥珀磺胺噻唑(ss)以抑制肠道叶酸的合成,膳食干预 8 周后合笼。Heid、Burgoon 等建立模型的方法与前者类似,不同的是在小鼠合笼前分别膳食干预 5 周和 4 周.本实验中叶酸缺乏组小鼠采用剔除叶酸的饲料配方,以控制外源性叶酸的摄入;并且为了最大程度地模拟孕妇在围孕期的低叶酸状态,并且便于独立评价叶酸缺乏对胚胎发育的不良作用,本实验并未采用 ss 肠道抑制剂,以排除其对胚胎发育的潜在影响。小鼠胚胎的器官形成期为第 10-14 天,因此我们选择13.5 dpc 器官形成的末期来观察叶酸缺乏对中孕期胚胎发育的影响。Bills N.D.等曾采用此方法成功建立了叶酸缺乏的小鼠模型,干预 5 周后发现小鼠体重、肝脏和红细胞等的叶酸含量都明显下降。廖国仪等人也采用类似方法建立了叶酸缺乏的孕鼠模型,通过孕前干预 2 周,发现孕晚期(E20 d)胎鼠的平均体重、鼻 - 臀长、脑重均低于对照组。本实验中雌鼠妊娠结局与上述文献结果一致,叶酸缺乏组雌鼠合笼前体重增长下降,孕鼠中吸收胎和死胎比率升高,胎鼠重量低于正常对照组,这说明在小鼠的孕中期,叶酸缺乏引起的胎鼠发育受限就已经得到了体现。以往实验虽表明叶酸缺乏会导致胎鼠重量下降,但均未严格的采用 IUGR 判定标准计算比率,本实验采用标准差法首次描述并判定了叶酸缺乏致小鼠胚胎 IUGR 的发生率。

  3.2 IGF 表达与 IUGRIGF
  系统包括两种配体(IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ),两种受体(IGF-ⅠR, IGF-ⅡR)、六种 IGF 结合蛋白(IGF-binding proteins, IGFB-Ps)、IGFBP 相关蛋白 (IGFBP-related proteins, IGFBP-rPs) 和一组 IGFBP 蛋白酶.IGFs 在局部组织环境中通过自分泌和 (或)旁分泌机制,配体和受体相结合,激活下游效应因子,发挥促有丝分裂作用, 并可诱导细胞分化和促进许多细胞分化后功能表达。IGFBPs 是与 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ有高结合力的一组蛋白,循环中 IGFs 的浓度随着 IGFBPs 的变化而变化,它们是 IGFs 生物功能的调节剂,能将 IGFs 转运并定位到特定的细胞中,延长循环中 IGFs 的半衰期以调控其促生长活性,其中 IGFBP-3 在血中的含量最高,是 IGFs 的主要载体蛋白,IGFBP-1 也能快速调节血浆中 IGFs 的活性, 并可在细胞水平上调节 IGFs 的物质.研究表明,IGFs 是调节胎儿生长发育的重要物质之一,亦是控制胎儿生长有效的有丝分裂素.由于肝脏是动物中叶酸存储和代谢的主要器官,也是产生 IGFs 的主要器官,所以我们选取胎鼠肝脏标本为研究对象,探讨 IGF 系统基因的表达变化。

  IGF-Ⅱ是重要的胚胎期生长因子,可在胎盘中调控糖原合成及合成细胞的量, 是调节葡萄糖转运的主要因子。IGF-Ⅱ不但可以促进细胞的增殖、分化、成熟,还可抑制细胞的凋亡;它可以介导生长激素的大部分作用,可促进机体的生长和合成代谢,并有调节免疫、降低血糖等作用,它还在肌肉和脂肪组织中具有胰岛素样作用,可通过和胰岛素 A 型受体高亲和性的结合从而发生细胞丝裂效应.IGFs 的生物学功能需要通过特异性的 IGF- 受体介导完成, IGF-ⅠR、IGF-ⅡR 两种受体分别与各自的配体以高亲和力结合, 只存在 10 %的交叉配体.IGF-ⅡR 是一种分布于细胞胞质和高尔基体上的跨膜糖蛋白,它在处于活跃增殖期的胚胎肝脏细胞内呈现高表达状态。自分泌生长刺激机制是肝癌细胞恶性增殖的重要原因,而 IGF-Ⅱ与IGF-ⅡR 的过量表达可能是其中一个分子基础.在本实验中叶酸缺乏组 13.5 dpc 胎鼠肝脏中 IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR 的表达量均低于正常对照组,说明两者可能存在协同作用。Calvo MT 等研究证实,IUGR 胎儿 IGF 基因表达明显受抑制。多项国内研究,通过对比分析 IUGR 孕妇和正常孕妇在孕中期及分娩时羊水、母血、脐血中 IGF 系统的表达,发现无论在孕中期还是分娩时,IUGR 组脐血或羊水中 IGF-Ⅱ水平都较对照组显着降低.

  动物研究发现,IGF-Ⅱ基因敲除鼠显示出明显的 IUGR 及胎盘缩小, 虽生后可显示近似正常的生长速率, 但实际体重、身长仍低于正常对照鼠,同时敲除 IGF-Ⅰ及 IGF-Ⅱ基因鼠显示严重 I-UGR, 所有鼠生后均死于呼吸衰竭.另外,Lassarre 等发现,IGF-Ⅱ基因过度表达, 胎儿体重及生长发育速度明显增加。以上实验结果证实了 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 在胎儿生长发育中的重要作用,与 IUGR 密切相关。

  3.3 叶酸缺乏与 IGF
    Santoso MI研究过叶酸缺乏与 TGF-β1 和 IGF-Ⅰ表达量之间的关系,发现叶酸缺乏组母鼠血清和胎鼠颅骨中 TGF-β1和 IGF-Ⅰ的表达量都比对照组低;近期 Kim HW的研究表明父体叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑部整体甲基化降低,并使 IGF-Ⅱ蛋白表达量下降。研究提示叶酸缺乏会影响 IGF 系统中相关基因的表达,而在本实验建立的叶酸缺乏小鼠模型中,胎鼠肝脏组织 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达量也发生了类似下降。由于叶酸为蛋氨酸合成所必需,而蛋氨酸的代谢中间物 S- 腺苷蛋氨酸在甲基转移酶的作用下转变为 S- 腺苷同性半胱氨酸的过程为体内广泛存在的甲基化反应提供甲基,而 DNA 的甲基化是调控基因表达的重要形式。有研究表明,IGF-Ⅱ基因的差异性甲基化区(DMR) 去甲基化状态使其能与增强子阻遏蛋白(CTCF) 结合,CTCF 能阻断增强子对 IGF-Ⅱ基因启动子的作用,使 IGF-Ⅱ不能有效地转录,进而降低 IGF-Ⅱ基因的表达.在本实验中,IGF-Ⅱ表达水平的降低,可能是由于母鼠的叶酸缺乏状态影响 IGF-Ⅱ基因 DMR 区的甲基化程度引起的。由于体内循环中 IGF 因子减少,可能无法满足细胞生长的正常生理需要,进而影响胚胎的生长发育。

  综上所述,本文通过建立围孕期叶酸缺乏的小鼠模型,研究了母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育和肝脏 IGF 系统基因表达的影响,结果表明叶酸缺乏会引起孕中期小鼠 IUGR 率增高且降低13.5 dpc 胎鼠肝脏内 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达水平。研究结果提示,叶酸缺乏对 IGF 系统基因的调控,可能参与到胎鼠 IUGR率增高的机制之中。胎儿的生长是多因素共同作用的,本文对与胚胎发育关系较密切的部分 IGF 基因进行了测定, 除 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达量发生变化外,其他基因未发生变化。在后续研究中,将扩大样本量,检测组织叶酸浓度,并对 IGF 基因的甲基化程度进行测定,进一步探讨叶酸缺乏改变 IGF 基因表达、影响胚胎发育的机制。
  
  参考文献(References)
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