国内外硒代氨基酸的形态检测方法综述

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摘要

  硒是人体所必需的一种微量元素,它能提高人体的免疫力,并能预防许多种疾病,在机体中它有重要的生理作用[1-3],硒是谷胱甘肽过氧化酶、5. -脱碘酶的必需组成部分,同时又是体内许多蛋白质的组成成分,对动物机体抗氧化、抗应激、提高免疫力等起着重要的作用。随着人们对硒研究的深入,硒对动物机体的重要作用越来越受到重视。

  世界卫生组织公布的资料表明,全世界有 40多个国家和地区不同程度的缺硒,我国 2/3 的地区属于缺硒地区,29. 00% 的地区严重缺硒[4].已经证明,硒的形态是影响生物对其吸收和利用的重要因素。无机亚硒酸钠毒性高,且动物对无机硒吸收利用率不高,而人的安全膳食硒摄入量为 50 ~ 500μg/d,与中毒剂量 (750 μg/d) 相差范围小,故以亚硒酸钠作为动物及人体补硒的直接硒源,其风险大; 生物大分子结合态有机硒安全、生物活性好、吸收率较高,所以有机硒补剂产品的开发和研究受到了广泛关注。由于有机硒的基本存在形式为硒蛋白。

  硒仅以硒半胱氨酸(selenocysteine,SeCys) 和硒蛋氨酸(selenomethionine,SeMet) 两种形式共价结合在蛋白质中[5].因此,在人们的补硒过程中必须关注量的问题,在富硒食品、药品、营养品和保健品的开发研制过程中对产品硒含量和硒形态的检测显得尤为重要。测定有机硒的手段很多,不同的提取过程和测定方法,其灵敏度和适用范围各不相同,对近年来国内外有机硒硒蛋白中硒代氨基酸的形态检测方法进行了综述。

  1 硒形态样品的提取

  在水解过程半胱氨酸残基的侧链琉基不稳定,易断裂,因此选择适合的提取方法是测定硒蛋白中硒代氨基酸含量的关键[6].

  在小分子硒形态方面,主要包括水提取法、酸提取法和酶提取法[7].水提取对一些非结合蛋白形式的硒形态较适合,如硒 - 甲基硒代半胱氨酸、γ - 谷氨酰基 - 硒甲基硒代半胱氨酸,但对以蛋白形式结合的硒,回收率较差; 酸提取法有很高的回收率,但酸易使硒形态发生转变。

  早在上世纪五十年代,就有人对硒氨基酸的水解进行研究,Whitchead 认为在除氧传统酸水解条件下,硒蛋氨酸稳定,1961 年,Blau 指出硒蛋氨酸(seMet) 在 6mol/L Hcl、110℃、7h 水解中几乎全部被破坏; 1969 年,Shepherd 也得到同样的结论。显然,这是两个矛盾的结论。1981 年,Beilstein 认为在惰性气氛中,游离态的硒半胧氨酸的回收率常量、微量达到 80. 00% ~90. 00%,但此结论是否适合硒蛋白中结合态硒氨基酸还有待进一步确证。1985 年,刘曼西卿认为改变传统水解法,采用低酸度、低温度、长时间条件,可提高硒氨基酸的回收率,1986年,Syliva 等认为加入还原剂并通 N2,可提高硒蛋白的稳定性; 1988 年,谢丽琪、欧阳政在上述基础上提出除氧改良水解法,该法对结合态硒蛋氨酸的回改率达 84. 00%.

  Gergely 等[8]分析双孢蘑菇(Agaricus bisporus) 、香菇中的硒形态时,比较了 3 种蛋白质提取方案(0. 1mol/L NaOH,30mmol/L Tris - Hcl 缓冲液,酶消解) 的效果,发现 24h Tris - Hcl 缓冲液提取,加入丙酮的方法提取水溶态的含硒蛋白质效果最好; 在利用酶体系进行消解时,胰蛋白酶在 50℃的条件下处理 24 h 可以达到比较高的降解和提取效率。同样是分析富硒双孢蘑菇(Agaricus bisporus) 中的硒形态,Stefa'nka 等[9]采用三步提取法(水提取,胃蛋白酶提取,胰蛋白酶提取) 对样品中的硒进行浸提,提取效率达到 75%; 用高效液相色谱和水力高压雾化器连用对浸提液进行分析,成功检测出 SeCys2 和 Se(Ⅳ) ,检出限达到 0. 25 mg/L.

  酶提取法的应用最广(表 1) ,常用的酶有蛋白酶 K,蛋白酶 XIV,胰蛋白酶,胃蛋白酶和链霉蛋白酶等。酶提取法通常在温和的条件下(37℃,pH7. 0) 进行,可以减少硒形态之间相互转化,但此法提取的时间较长,一般需 24 ~48 h.Emese 等[10]对富硒北葱硒形态分析采用 2 种方法进行提取 : ①对于非蛋白硒 ,用高氯酸 - 乙醇(8∶ 2) 提取; ②对于蛋白硒,采用酶解法。首先蛋白酶 K 溶于 pH 7. 5的三羟甲基氨基甲烷(Tris) 缓冲液(包含 1 mmol/L- 1 氯化钙 2) ,所得到的溶液加入到韭菜样品中,在 50 ℃下搅拌 15 h,后再加入蛋白酶 XIV,同样在50 ℃ 下搅拌 15 h.在第 1 种提取方法下 ,检测到MeSeCys,SeCys2,Se (Ⅳ) 和 Se (Ⅵ) 等 4 种硒形态,用第 2 种提取方法,检测到 5 种硒形态(多检测出 SeMet) ,且酶解法得出的有机硒形态含量高于第1 种方法。

  按照使用辅助仪器的不同,分为萃取提取、振摇提取、超声提取、离心提取、微波提取等,其中超声微波结合酶提取法可以有效地缩短提取时间[18],加压液体萃取法(PLE) 是未来研究的方向之一。该方法在分析锡和砷形态分析上得到应用,但在硒形态分析上应用较少[19].

  2 硒形态分离技术

  2. 1 气相色谱法 气相色谱法(GC) 测定硒及硒的化合物,需要将其衍生成挥发性的有机硒化合物,然后经过萃取和色谱两次分离,消除共萃取物的干扰,同时结合高灵敏度和高选择性检测器,可以准确地对硒的形态进行定性和定量。气相色谱可以用来分离挥发性的二甲基硒、二甲基二硒; 如果分离硒氨基酸需要用衍生法增加其挥发性。Beril 等[20]用 GC - MS 进行硒酵母中硒的形态分析时,用氯甲酸乙酯衍生法分离、测定富硒酵母中的硒蛋氨酸、硒半胱氨酸,试验证明该法能够迅速、有效地分离、测定两种氨基酸。目前已用于食品强化剂中硒化合物的测定。

  2. 2 毛细管电泳法 毛细管电泳(CE) 以其分离效率高,样品用量少,无填充物影响目标化合物稳定性等优点,大量用于硒化物的分离。目前发展的毛细管电泳方法有: 毛细管区带电泳(CZE) ,毛细管等电聚焦(CIEF) ,毛细管电色谱(CEC) ,毛细管凝胶电泳(CGE) 等方式[21]而其中毛细管区带电泳进行形态研究较多的一种元素是硒,可通过调整毛细管内壁涂层和电解质的组成来改善分离效果。

  毛细管电泳与紫外和可见光检测已用于金属硫蛋白的分离。Sasi[22]等用毛细管电泳的方法分离巴西干果提取液中的各种含硒物质,ICP - MS 检测,在7 min 内分离出亚硒酸、硒酸、硒胱氨酸和硒蛋氨酸。

  2. 3 液相色谱法 目前在硒形态分析方法学的研究中,高效的动态分离技术与高灵敏的检测技术联合使用占据了主要地位。作为高效的分离技术,液相色谱(HPLC) 在硒形态分析中得到广泛的应用,是迄今为止硒形态分析中使用最多的分离方法。

  HPLC 分离技术有尺寸排阻色谱(SELC) 、离子色谱(IC) 、离子交换色谱(IE) [包括阴离子(AE) 和阳离子(CE) ]、手性色谱 CLC) 和反相色谱(RPLC) .尺寸排阻色谱(SELC) 主要应用于硒蛋白、硒多糖的检测以及硒与蛋白相互作用的研究中。铁梅等[23]分别采用 SEC - HPLC - ICP - MS 和 RP - HPLC - ICP- MS 技术对富硒金针菇中的含硒化合物进行分析,确定了富硒金针菇中含有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和由二者组成的含硒多肽等,各形态硒的含量分别为总硒量的 12. 30%、17. 60% 和 36. 80%.IE 和RPLC 主要应用于 Se(Ⅳ) 、Se(Ⅵ) 、硒蛋氨酸和硒半胱氨酸等含硒氨基酸的分离[24].仲娜等采用离子对试剂对海带中硒的形态进行反相液相色谱分离,不需柱前衍生化即可有效提高样品分离效率,且条件适于 ICP - MS,采用 C18 柱分离,柱效高,峰形尖锐,保留时间长,可分离出亚硒酸钠、硒甲基半胱氨酸(MeSeCys) 、硒代蛋氨酸(SeMet) 三种形态,分离效果好[16].Zheng 等使用含混合离子对试剂(2. 5mmol/L 丁基磺酸盐,8mmol/L 四丁基氢氧化铵、4 rnmol/L/丙二酸、0. 05% 甲醇) 的流动相对硒形态进行分离,此混合离子对试剂可同时分离阳离子、阴离子和电中性的多种硒形态[25].韦昌金等采用 PRP - X100 阴离子交换分析柱可以在 10 min 内同时分离出 4 种 As 形态和 3 种 Se 形态[26].反相色谱分离模式中组分的洗脱顺序与其和固定相之间的疏水性作用的强弱相一致。Gomez - Ariza 等采用甲醇和水作流动相在 C18 反相柱上成功分离了硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代乙硫氨酸[27]
.Susan等[28]通过柱前衍生将硒代氨基酸进行转化,进而用反相色谱成功地分离了 3 种硒代氨基酸,获得了比离子交换分离模式更高的柱效。

  高效液相色谱、毛细管电泳以及气相色谱是目前研究较多且应用较为广泛的 3 种分离技术。其中又以高效液相色谱法的应用最多,根据实际样品的特点研究人员选择合适的色谱体系,按照某种色谱分离模式对化合物实现分离以及检测。

  3 硒形态检测技术

  硒的检测方法很多,如光度法,催化动力学法,极谱法,荧光法[29,30],伏安法等,目前,运用电感耦合等离子体质谱,原子荧光测定硒的报道较多。

  3. 1 电感耦合等离子体质谱法(ICP - MS) 电感耦合等离子体质谱法(ICP - MS) 是上世纪 80 年代发展起来的一种理想的多元素同时检测技术,虽然该技术灵敏度高在微量元素分析中具有独特的优越性。然而,对于 Se 元素,ICP - MS 的检测能力却大为逊色,这主要是因为 Se 元素具有较高的电离能(9. 75eV) ,在氩等离子体中电离程度较低,所以灵敏度较差。这些问题的存在严重制约了普通型 ICP- MS 检测硒的灵敏度和准确性。ICP - MS 分析中常采取的减少干扰的方法主要有以下几种: ①选择多个同位素同时监测; ②应用动态碰撞池或者反应池系统,通过反应气体与多原子离子进行碰撞或反应再选择性地消除多原子离子的干扰; ③采用高分辨的双聚焦质量分析器; ④应用可调离子气源,低压ICP(L P2ICP) 、微波诱导等离子体(MIP) 和辉光放电(GD) 用氦气作为等离子体气,可以避免氩的聚合物的光谱干扰。高效液相色谱(HPLC) 和电感耦合等离子体质谱(ICP - MS) 联用是发展较为完善的技术之一。HPLC - ICP - MS 联用分析技术是以各种不同的色谱分离柱完成不同种类样品分析物的分离,以高灵敏度的 ICP - MS 担任信号检出,具有元素专一性、线性范围宽和检测限低等特点,是具有高灵敏度和高选择性的形态分析系统,而且形态分析时不需要复杂的样品前处理和复杂的接口,只需HPLC 的流速和 ICP - MS 的进样速度相匹配,近年来在元素形态分析中已得到广泛的应用。HPLC -ICP - MS 的联用及其在元素化学形态分析中的应用已有许多文献总结。

  高分辨能力的色谱技术和强鉴定能力的质谱技术的结合在微量有机硒化合物的分析测定中得到充分应用。Kyoden 等[31以水解蛋白酶消解,凝胶柱色谱和薄层色谱分离,GC - MS 测定了大豆蛋白中的硒蛋氨酸。Christoph 等[32]用反相 HPLC 分离结合 ICP - MS 测定了硒胱氨酸、硒蛋氨酸、硒胱胺、硒乙硫基氨基酪酸,并讨论了流动相的组成、pH 以及样品的 pH 和吸入速度。检出限分别为 0. 008ng/ml、0. 016ng / ml、0. 009ng / ml、0. 18ng / ml.Michalk[33]用毛细管电泳分离结合 ICP - MS 测定了人奶、血浆中 Se(Ⅳ) 、Se(Ⅵ) ,检出限为10. 0 Lg/L.

  3. 2 原子荧光测定法 原子荧光分光光度法和原子吸收分光光度法比较成熟、简单易行、使用普遍,所以在很多联用技术中多有使用。Amit 等[34]用直接氢化物发生原子吸收方法检测人尿中的硒蛋氨酸,检测限是1. 08 μg/L,校准曲线在0 ~30 μg/L 范围内呈线性相关。

  4 展 望

  目前硒元素形态分析已经有了一定的发展,多种技术联合使用是硒形态分析的主流,高效连接各种分离方法和检测系统的结构技术是研究的焦点。由于硒在实际样品中存在的多样性和复杂性,还需要继续挖掘现有结构鉴定技术的潜力,合成提供更多不同硒形态的标准物质。方法的实用化和标准化是联用技术真正应用于硒形态分析的必要步骤。

  参考文献:
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