目前单克隆抗体药物研发的一般流程

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论文摘要

  国家十二五规划中明确提出: 增强新药创制能力,加快单克隆抗体药物的研究,重点开发治疗恶性肿瘤的抗体药物,突破生物技术药物产业化的技术瓶颈,开发自主知识产权产品,抢占世界生物技术制药的制高点.笔者主要总结了目前单克隆抗体药物研发的一般流程,为发现、降低研发技术风险提供参考.

  1背景与现状

  随着当前工业化、城市化、老龄化进程的不断推进,生态环境的恶化和生活压力的不断加大,恶性肿瘤的发病率越来越高.近20 年来我国癌症有年轻化趋势,发病率和死亡率"三线"不断走高,每年新发肿瘤病例约为 312 万例,平均发病率为 285. 91 /10万,平均每分钟有 6 人被诊断为恶性肿瘤.

  恶性肿瘤的严重性导致肿瘤治疗的需求不断增加,抗肿瘤药物的种类不断增加,药物市场迅猛发展.2007 年以来,抗肿瘤药物一直是全球医药市场的领头羊,目前全球流行的抗肿瘤药物主要是生物药物、靶向小分子药、激素等.单克隆抗体(McAb,简称单抗) 技术又被称为肿瘤"生物导弹",是能直接导向肿瘤的药物[ 1 - 2 ].单抗抗肿瘤药物以其良好的临床效果和极佳的生物靶向性,稳居抗肿瘤药物的前 3 位[ 3 ].2007 年至 2011 年全球抗肿瘤药物销售总额前 5 名中,利妥昔单抗 291. 65 亿美元,贝伐单抗261. 3 亿美元,曲妥珠单抗 247. 33 亿美元,伊马替尼 195. 88 亿美元,亮丙瑞林 116. 89 亿美元.可见,2007 年到 2011 年抗肿瘤药物的销售额巨大,排名前 3 位的都是以单抗技术制备的抗肿瘤药物.2012 年,利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗的销售额分别达到了 56. 22 亿、58. 89 亿和 57. 64 亿瑞士法郎,占其制药公司药品收入比重的 16% ,17% 和 16%[ 4 ].

  单抗肿瘤药物的市场需求巨大,形成鲜明对比的是,我国单抗抗肿瘤药物研发能力的薄弱.单抗抗肿瘤药物的研发壁垒高,我国单克隆药物技术和国外先进水平有很大差距.单抗抗肿瘤药物的巨大市场需求和国内现阶段的技术发展水平,促使我们必须降低新药的研发风险,增强单抗抗肿瘤药物的研发能力.

  2研发的一般流程及风险分析

  2.1肿瘤靶点的发现和选择

  新药的研发过程时间较长.据美国食品药物管理局(FDA) 统计,一种新药从研发到最后投入市场平均需要 12 年,其中实验室研究阶段需占用约 5 年时间[ 5 ].药物靶标是新药研发的基础,单抗抗肿瘤药物研发正是要找到相关肿瘤靶点,才能研制出针对肿瘤疾病的抗体药物.单克隆抗体药物出现的 30 多年来,针对抗肿瘤药物的靶点,已经研制出多种单抗药物.目前已发现的肿瘤靶点和肿瘤药物如表 1 所示[ 6 - 8 ].对未知靶点研究的缺乏制约着单抗抗肿瘤新药的研发,随着以基因工程和分子生物学为代表的生物技术的发展,使针对靶点的高通量筛选成为可能,肿瘤靶点的研究不断深入,靶点集中于细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面[ 9 ].目前国内单抗抗肿瘤药物靶点的发现主要基于 3 个纵向层次的研究,即基因水平、转录水平和蛋白水平的靶点发现[ 10 ].

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  基因水平的单抗药物靶标发现: 从基因库中搜寻,人类基因组的不断发展,扩大了新基因的筛选范围,根据建立的基因数据库,通过计算机模拟,就会增加药物靶标发现的概率; 基因芯片技术,利用核酸杂交和碱基互补配对,用大量生物分子检测样品的遗传信息,筛选药物靶标[ 11 ]; 基因敲除技术,是指对 1 个结构已知而功能未知的基因,从分子水平上设计试验,将该基因去除或用其序列相近的基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能,发现药物的相关靶点.

  转录水平的单抗药物靶标发现: 主要分为反义寡核苷酸技术和 RNA 干扰技术,对于单抗抗肿瘤药物运用最广泛的是 RNA 干扰技术.该技术能特异、高效地抑制基因表达,引起功能表型丢失,可以确定相应蛋白质功能,快速有效地鉴别药物新靶点.

  蛋白水平的单抗药物靶标发现: 噬菌体展示技术,利用肿瘤外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用,将特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集,然后通过测序分析噬菌体表面展示的蛋白结构,发现可与药物特异性结合的靶点; 蛋白芯片技术,是以蛋白质代替 DNA 作为检测对象,测基因的表达和蛋白分子间的相互作用,以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子;三杂交系统,利用蛋白质间的相互作用,可检测出与特定小分子作用的蛋白,从而发现肿瘤靶点.

  目前靶点发现存在的困难可总结为以下几个方面: 基因水平筛选的风险主要来自于基因技术发展还不成熟,对所有基因的作用不明了导致获得靶点的效果不理想[ 10 ]; 转录水平筛选的风险主要来自 RNA 干扰技术,该技术在肿瘤细胞中转染效率较低,动物体内和人体内结果的相似性有待考察,在特异性设计上还有较大难度[ 12 ]; 蛋白水平筛选风险来自噬菌体展示的容量大小,特异性检测水平的程度以及筛选后蛋白功能具体测定的精确度[ 13 ].

  2.2单抗抗肿瘤药抗原制备

  靶点明确之后,就可以进入抗原的制备阶段.根据特异性的不同,肿瘤抗原可以分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原; 根据抗原种类的不同,可分为天然蛋白质抗原、基因重组抗原、合成性抗原和小分子半抗原.就抗体制备而言,天然抗原的效果最好,运用反复冻融法、超声破碎法等直接从肿瘤标本中分离抗原; 基因重组抗原是指将目的基因插入载体,在原核或真核系统中表达,获得相应抗原; 合成性抗原是根据蛋白的氨基酸序列,通过抗原表位分析找到抗原性好的多肽片段,通过固相合成制备抗原; 小分子半抗原分子量较小,免疫原性较弱,必须与载体连接之后才能产生免疫应答反应.

  制备出的抗原,根据性质可分为颗粒型抗原和可溶性抗原,可溶性抗原要添加佐剂增强免疫原性.从纯度上来说,虽然要求不高,但高纯度的抗原能提高抗体获得的可能性.目前纯化抗原的定性鉴定的常用方法有亲和层析法、双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酞胺凝胶电泳等.纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法[ 14 ].

  2.3抗肿瘤单克隆抗体制备

  2. 3. 1杂交瘤技术

  单克隆抗体制备的基本原理是,致敏的 B 淋巴细胞能分泌特异性抗体,但这些细胞不能在体外存活.骨髓瘤细胞可在体外大量繁殖的 HGPRT 缺陷株,但不能分泌特异性的抗体.将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的 B 淋巴细胞融合,则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性,又具有 B 淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力.由于每个致敏的 B 淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体,所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体[ 15 ].国内杂交瘤技术生产抗体的技术相对较为成熟,主要包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、目的抗体检测、杂交瘤细胞的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单抗的鉴定( 包括纯化、效价测定、亚型测定、染色体数目检测、特异性检测、结合位点和亲和力检测) 等环节[ 16 - 17 ].

  杂交瘤技术对于单抗药物的研发有着划时代的意义,但随着研究的深入,其自身特点就为单抗抗肿瘤药物的研发带来了风险: 通过人肿瘤细胞免疫动物,不能产生足够量的抗体,人和以小鼠为代表的实验动物有很高的同源性,功能性蛋白易造成耐受状态; 另一方面,人和动物的同源性还是有一定的区别,动物产生的抗体所带有的免疫原性引起的 HAMA 反应又是人用药所不能忽视的.

  2. 3. 2抗体人源化技术

  在基因工程快速发展之前,单克隆抗体的制备到杂交瘤细胞筛选出阳性克隆、检测抗体亲和力和特异性为终点.但严重的免疫原性制约了单抗抗肿瘤药物的发展,基因工程的快速发展推动了抗体药物的人源化改造,在鼠源抗体上进行人为改造并获得成功.贝伐单抗、西妥昔单抗等都是通过人源化改造所得,在肿瘤临床的效果和市场效益方面取得了巨大成功[ 18 ].抗体人源化改造包括 2 种,即嵌合抗体和改型抗体.

  嵌合抗体: 是最先出现的人源化单克隆抗体,其可变区来自鼠单克隆抗体,恒定区来自人的单克隆抗体.国内普遍采用的技术是从制备好的杂交瘤分离出功能区基因,插入适当的表达载体中,获得人源化嵌合抗体[ 19 ].一般用 PCR 方法将鼠源单抗 V 区基因克隆,与带有人 CL 区和 CH 区的载体相拼接,构建嵌合抗体蛋白载体,将表达载体转染到同一哺乳动物细胞内表达.嵌合抗体制备抗肿瘤药物过程中的风险不能忽视,嵌合抗体保留的鼠抗体的可变区占整个抗体结构的 30% ,仍能引起较强的免疫原性,解决 HAMA 反应的效果并不理想,同时还引起了抗嵌合抗体反应(HACA)[ 20 ].这一风险直接制约了嵌合抗体技术研发抗肿瘤药物的前景.此外,国内技术的不成熟会导致人源化抗体的特异亲和力降低,抗体表达产量、表达载体的构建也是影响嵌合抗体成药前景的风险因素.

  改型抗体: 在嵌合抗体的制备过程中,又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以提高抗体的人源化,形成人源化更高的改型抗体[ 21 ].改型抗体,又称互补决定区(CDR ) 移植抗体,是把鼠单抗的 CDR 移植到人单抗的骨架区(FR) 构建而成的抗体[ 22 ]; 这进一步降低了鼠单抗的异源性,仅有 9% 的序列来源于亲本鼠单抗[ 23 ].抗体分子的可变区是由 CDR 和 FR 两部分构成,VH 和 VL中各有 3 个 CDR 和 4 个 FR,VH 和 VL 上的 6 个 CDR 折叠成环状,形成抗原结合位点,抗体的特异性和亲和力主要由此区决定.

  FR 的基本序列保守,在不同的抗体间具有较高的同源性,CDR 在序列和构象上的变异对 FR 构象影响较小,同一抗体的 FR 可适用于不同抗原结合位点的移植,抗体分子的上述结构特性提供了设计和构建改型抗体的物质基础.改型抗体的免疫原性进一步降低,人源化达到了 90% ,但潜在的 10% 鼠源性仍有引起人体产生抗独特型免疫反应的风险; 就国内技术而言,可选择的人源 FR模板较少,且 FR 模板是不可以随意替代的,CDR 移植后抗体与抗原的结合能力会减弱[ 24 ].这些都是改型单抗抗肿瘤药物研发过程中不能忽略的风险因素.

  2. 3. 3全人抗体制备技术

  单克隆抗体的人源化改造确实降低了鼠源程度,但鼠源免疫原性仍然存在,同时人源化改造过程复杂、实验周期长,获得的抗体质量不稳定.20 世纪 90 年代以来,以噬菌体抗体库技术为代表的全人抗体制备技术逐渐发展并不断成熟,开拓了单抗抗肿瘤药物研发的新思路.全人抗体的制备包括抗体库技术和转基因小鼠技术[ 25 ].通过全人抗体制备技术得到的抗体进行 ELISA 活性鉴定,酶切鉴定及可溶性表达,最终得到单克隆抗体[ 26 ].可以看出,全人抗体制备的关键风险因素,在于筛选技术的成熟与否、检测水平的精确度、恰当技术的选择.

  1) 抗体库技术噬菌体抗体库技术: 是基于噬菌体展示技术发展起来的抗体库技术,是一项基因重组的方法.将编码外源基因的 DNA 片段利用基因工程的方法,导入到噬菌体载体上,将外源基因表达的蛋白与噬菌体蛋白融合,展示在子代噬菌体表面,一般得到抗原结合片段(Fab 片段) 或单链抗体(scFV) .噬菌体抗体库除依靠噬菌体展示技术外,还依靠 PCR 技术和大肠杆菌分泌的有效免疫蛋白.

  目前噬菌体抗体库的构建方法是从人的淋巴细胞、肿瘤细胞通过PCR 方法提取总 RNA,反转录成 cDNA,构建文库.王净等[ 27 ]通过PCR 等方法构建成半合成、合成、天然或免疫的全人抗体库,然后用已知抗原直接从全人抗体库中通过亲和筛选或全细胞筛选方法等得到与此抗原结合的噬菌体颗粒,再经历一次体外融合,就能产生具有完整功能的全人抗体.但噬菌体抗体库技术制备的抗体通常为 Fab 片段或 scFv 片段,由于没有 Fc 片段而使亲和力降低,受到外源基因的影响,导致转化效率受到影响,这些是噬菌体抗体库技术制备全人抗体的主要风险.

  核糖体展示技术: 其基本原理是通过 PCR 扩增目的基因的DNA 文库,同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环,并置于具有耦联转录 /翻译的无细胞翻译系统中孵育,使目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面,并形成"mRNA - 蛋白质 - 核糖体"三元复合体,翻译出来的抗体可用肿瘤抗原进行筛选,最后通过常规的免疫学检测方法,通过固相化的靶分子直接从复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体,再利用 RT - PCR 扩增,经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力的目标分子[ 27 ].但核糖体展示技术表达的蛋白质折叠和转录后修饰功能与目标所要的蛋白功能有冲突,故其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力往往较低,表达及纯化难度大.

  2) 转基因小鼠技术其抗体生成过程是从鼠抗体生成基因被相应的人基因所取代的小鼠开始的.转基因小鼠的 Ig 基因是用人的相应基因替代,产生对人免疫系统非异种抗体.这种影响人抗体的策略是改造小鼠的体液免疫系统,将人 Ig 基因微位点转入小鼠,产生能分泌人Ig 的转基因小鼠.利用鼠体体内亲和力的成熟机制,一步即能产生一系列高亲和力的全人单抗[ 28 - 29 ].理论上讲,转基因小鼠是目前生产全人单抗的最理想方法,但技术难度较大,国内并未获得真正的突破.

  2.4抗肿瘤单克隆抗体功能鉴定

  获得抗体之后,要进行抗体功能鉴定.特异性是指抗体选择性地与某种或某类抗原结合的特性,亲和力则是抗体结合部位与抗原决定簇的结合强度,抗体的特异性和亲和力是鉴定抗体特性最重要的两个指标[ 27 .单克隆抗体的靶向治疗通过抗体依赖性细胞介导细胞毒性反应和补体依赖细胞毒性反应杀伤肿瘤细胞; 通过抗体竞争地与受体结合,干扰配体 - 受体的结合和相互作用,影响其发挥生物效应,抑制肿瘤生长; 抑制肿瘤新生血管形成,限制肿瘤的生长和转移; 与受体结合直接诱导肿瘤细胞凋亡; 产生抗独特型抗体,引起针对抗独特型抗体的免疫应答等[ 15,26,30 ].提取肿瘤细胞,发现肿瘤表面相关标志物,采用酶联免疫吸附试验(ELISA) 、免疫组织化学(IHC) 、流式细胞学(FACS) 、免疫印迹杂交(Western blot)、免疫共沉淀等技术检测[ 31 - 33 ]单克隆抗体特异性结合抗原的性质.通过临床标本验证和交叉反应测试,检测抗体对肿瘤细胞的杀伤效果和不良反应.所有检测过程都应符合要求后,才能进行抗体的大量生产.

  3结语

  从国内单抗抗肿瘤药物的研发环节来看,主要分为靶点发现、靶点选择、抗原制备、单克隆抗体制备技术的选择以及抗体功能鉴定 5 个部分.其中靶点可以从基因水平、转录水平和蛋白水平 3 个方面发现和选择,这 3 个方面的技术均存在各自的风险和缺陷; 单克隆抗体制备技术集中于杂交瘤技术、人源化技术和全人抗体制备技术,3 项技术各有利弊,目前哪种技术更具优势还没有共识.在各个环节中,可以通过不同环节的技术特点发现影响研发成果的风险因素,找到风险因素,并运用风险管理的思维和方法进行分析.由此,新药研发管理者们就可以科学地避免或降低研发过程中技术风险带来的损失,加快肿瘤抗体药物的研发进度,尽早大力使新药研发向中下游推进.

  参考文献:

  [ 1 ] 陈 光 . 单克隆抗体技术历史与发展简述 [ J ] . 生物学通报,2003,38 ( 9 ) : 36 - 39.

  [ 2 ] 王 波,王发斌,张延威,等 . 单克隆抗体研究进展 [ J ] . 北方药学,2012,9 ( 8 ) : 40 - 41.

  [ 3 ] 田 红,肖桂芝,刘永贵 . 抗肿瘤药物市场分析 [ J ] . 现代药物与临床,2013,28(3): 425 - 427.

  [ 4 ] lily - cha. 单 抗 药 物 市 场 之 春 秋 五 霸 [ EB / OL ] . ( 2013 - 10 - 17 )

  [5 ] 王友同,吴梧桐,吴文俊 . 我国生物制药产业的过去、现在和将来 [ J ] .药物生物技术,2010,17(1): 1 - 14.

  [ 6 ] 陈 炅,尹笋君 . 治疗性单克隆抗体的作用靶点及临床应用概述 [ J ] .中国药师,2013,16(12): 1 930 - 1 932.

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